Zmall Pharma

Как синтезировать аффинный сорбент. Эпокси активация матрицы

Продолжение постов про получение аффинных сорбентов (начало - тут).

Эпокси активация сефарозы - это классический способ активации , при котором на поверхности матрицы формируются эпоксигруппы, способные к ковалентному связыванию лигандов. Я активировал эпихлогидрином, простым и доступным эпокси-реагентом. Еще круче - активировать бис-оксиранами (1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир), но он дороже. Руслан @Biophyschem рассказывал, что успешно использовал для активации технический 1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир купленный на озоне - она используется как разбавитель эпоксидной смолы.

После активации на сефарозе появляются эпоксигруппы, которые могут реагировать с аминными, тиольными и гидроксильными группами лигандов, что делает метод универсальным по сравнению с CNBr. Если вы беспокоитесь о токсичности BrCN - эпоксиактивация отличная альтернатива.

Преимущества этого метода:
1. Менее токсичные реагенты, по сравнению с BrCN
2. Можно связывать не только по аминогруппам, но и по тиолам и даже гидроксилам (всего-то нужно поменять pH конъюгации)
3. По сравнению с BrCN активацией связь гораздо прочнее, практически отсутствует утечка лиганда. Проще повторно использовать.
4. Связь образуется через гидрофильный спейсер, в случае эпихлоргидрина это три атома углерода, если брать диглицидиловые эфиры -от 6 до 12!
5. Активированный сорбент можно хранить и использовать позднее.
6. Не остается заряженных групп.

Недостатки тоже есть:
1. Реакция иммобилизации происходит в щелочных условиях, не всем белкам может подойти
2. Активация проходит дольше
3. По моему опыту - как будто бы емкость получается ниже, чем в случае BrCN
4. Эпокси реагент помимо активациии сорбента может и участвует в кросс-сшивке, с уменьшением пористости микросфер.

Для проведения эпоксиактивации я использовал метод, описанный в статье Matsumoto (1979). В замечательной книге Hermanson на стр. 691 также есть протокол (но без DMSO и более долгий). Если кратко - сефарозу ресуспендируют в смеси 0,4M NaOH и DMSO, добавляют эпихлоргидрин и оставляют активироваться на 2 ч при температуре 40С. Потом остается только отмыть, добавить белок в щелочном буфере и проинкубировать. После конъюгации сорбент нужно отмыть и заблокировать оставшиеся эпокси группы и снова отмыть. Неиспользованный активированный сорбент можно хранить в воде с консервантами в холодильнике.

Энжойте и получайте аффинный сорбент просто!

https://t.me/tolk_tolk/28561 - но стоит отметить, что материалы Пряников временами подгоняет крайне интересные. Вот цитата Щедровицкого, известного методолога:

И была у меня группа университетских преподавателей, с одной стороны, и замдиректора ПТУ - с другой. Проработав с ними полгода, я понял очень простую вещь: преподаватель физики или математики с университетским образованием просто тупарь по сравнению с замдиректора ПТУ, зачастую вообще не имеющего образования.

Заместитель директора ПТУ вынужден каждый раз решать житейские вопросы. Сегодня ему из милиции сообщение пришло, что его ребята кого-то ограбили или кого-то изнасиловали; завтра его вызывают в райком, и он прямо на ходу должен сообразить, как принимать участие в районном мероприятии; далее к нему приходят преподаватели, и он с ними вместе обсуждает, как проводить занятия по химии в одной группе, по физкультуре - в другой и как вывезти на картошку третью. И каждый раз он должен соответствовать запросу и принимать решения. Работа у него живая и в ситуациях. А это значит, что он должен каждый раз ситуацию проанализировать и понимать, т.е., как говорят, «сечь». Но самое главное, что в каждой возникающей таким образом ситуации нельзя опереться на опыт прошлых ситуаций, ибо они были другими. И соответственно каждый раз требуется новое решение.

А преподаватель математики или физики работает по методикам, нормативам, инструкциям, т.е. работает шаблонно. И чем меньше он отклоняется от методик, чем меньше новообразований туда вносит, тем оно считается лучше.

Что мы тут видим? Да это же... формулировка того самого советского отношения к умникам - "интеллигенция вшивая!". Т.е. СССР просуществовал так, в нём это не было кодифицировано, а вот на излёте понадобилось как-то сделать так, чтобы эта практика подавления шибко умных продолжилась. Полагаю, в этом и есть смысл этой "методологии". Сама бы советская практика не воспроизвелась, а так это как бы такой хитрый вариант технологий управления.

Щедровицкий по сути говорит, что вот есть умники какие-то, профессора там всякие, и деловитые решалы, кабанчики. И вот эти кабанчики, которые умеют быстро порешать вопросики, подскочить и обкашлять с кем угодно что угодно, де неизмеримо лучше бестолочей в очках. Которые чего-то там книжки читают, концепции заученные излагают, тьфу блин, а сами даже изнасиловавшего девку птушника не смогут от ментов отмазать! Ну и какой от очкариков толк тогда?

Как-то многое становится понятнее. "Методология" - это буквально методология интеллектуальной дегенерации страны, удерживания её в состоянии, когда ей командуют кабанчики-темщики, умеющие быстро решать тактические вопросы, но практически слепые в стратегии, в долгой игре. Это как раз мы позавчера на дискуссионном стриме обсуждали, что есть такая заметная особенность у коллективных новиопов. Ну и вот оно. 🤷‍♂️

А вообще, знаете, так вот подумалось. С точки зрения аристократа, кто такой этот кабанчик со скиллами по Щедровицкому? Да это же... расторопный слуга. Который как раз решает всевозможные житейские оргвопросики, освобождая от этого своего хозяина, которому остаются взрослые вопросы со взрослыми людьми. Дживс и Вустер. Или более классический сюжет: Труффальдино из Бергамо. И прочие итальянские комедии дель арто. Почему-то вот такое подумалось в связи с методологией, сам не знаю почему.

Экспланты из морского огурца Psolus fabricii, на разные сроки культивации.

Биологической науке всегда нужны модели, на которых мы исследуем всякие штуки.

Классика это, само собой, животные, потом появились культуры клеток и это был эпичный прорыв: можно культивировать штуку в банке и она реагирует почти как настоящая! Дёшево, доступно, удобно.

Но все таки, большая часть организмов устроены сложнее, чем отдельные клетки на пластике или в жидкости.

Потом появились всякие сфероиды, органоиды, ассемблоиды: гораздо более сложные штуки, но все равно невозможно более простые чем организм, со всеми его нервами, имунными клетками сосудами и прочей требухой.

И вот ученые из Канады предлагают новую модель: куски морского огурца! Причём конкретного вида - P. fabricii.

Авторы статьи обнаружили, что экспланты огурца, в которых есть и сосуды и имунные клетки можно культивировать годами без существенных признаков деградации, что невозможно для сложных кусков, например, мыши или даже огурца другого вида.

Сегодня в Nature вышла еще одна статья с моим ко-первым авторством со времен постдока, в которой совместно с коллегами из Канады и Германии мы исследовали механизм действия нового антибиотика, действующего против бактериальной рибосомы - маникомицина.

Чем замечательна эта история? Маникомицин - первый известный антибитоик, блокирующий Е-сайт рибосомы на большой субъединице, тот сайт, где деацилированные тРНК ожидают, прежде чем покинуть рибосому на следующем шаге цикла. Долгое время было неясно, насколько этот сайт вообще функционален у бактерий, но как оказалось, его блокада убивает весь биосинтез белка. И это здорово, поскольку маникомицин с самого начала не подвержен резистентностям, которые известны для других функциональных сайтов на рибосоме.

А моя коллега Манприт назвала новое вещество именно так по слову manik - на её родном пенджаби это значит "драгоценность, драгоценный камень".

#их_нравы

Теперь наконец-то можно: REFEREE 2 IS A DUMB CUNT

Когда читатель нашего Зоопарка поведал, что на совещании European Association of Science Editors всерьез обсуждалось, как надо обращаться с рукописями neurodivergent researchers (с), мы не поверили и пошли гуглить.

Нет, это не шутка. Есть целая программа, как поддерживать в науке тех, у кого, цитируем Вики:

autism, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), bipolar disorder, developmental prosopagnosia, developmental speech disorders, dyslexia, dysgraphia, dyspraxia, dyscalculia, dysnomia, intellectual disability, obsessive–compulsive disorder, schizophrenia, sensory processing disorder, synesthesia, and Tourette syndrome.

С одной стороны, мы смело можем сказать, что некоторые журналы ЕГПНИ и старорежимного списка ВАК в этом отношении действуют не просто на фронтире, а с серьезнейшим импортоопережением, уже давно публикуя людей с шизофазией, дисграфией и intellectual disability. Европа, догоняй!

С другой - идея с синдромом Туретта нам определенно нравится. Наконец-то можно честно и безнаказанно написать:

Dear Editor,

thank you and referee 2 CUNT ASSHOLE BASTARD FAGGOT for your valuable comments

🧫 Старение предлагают рассматривать как «мезенхимальный дрейф»

Новый обзор предлагает по-новому собрать биологию старения в единую схему. Вместо того чтобы рассматривать «признаки старения» как набор параллельных процессов, исследователи выдвигают концепцию mesenchymal drift, или мезенхимального дрейфа. Под этим понимают постепенную утрату клетками своей тканевой идентичности с одновременным приобретением мезенхимальных черт. Такая логика позволяет связать в одну систему фиброз, хроническое воспаление, ремоделирование внеклеточного матрикса и функциональный спад органов.

🩻Мезенхима — это «строительный материал» организма на ранних этапах развития: особая рыхлая эмбриональная ткань из подвижных клеток, из которой потом формируются соединительная ткань, кости, хрящ, жир, часть сосудов и другие опорные структуры. Клетки с мезенхимальными свойствами становятся более подвижными, менее специализированными и больше похожими не на рабочие клетки органа, а на клетки, которые участвуют в заживлении, рубцевании и фиброзе.

💡Суть концепции
Мезенхимальный дрейф описывается как направленный и нарастающий процесс клеточной «разгерметизации». В норме клетки удерживаются в стабильных состояниях, а при старении и хроническом повреждении эти состояния становятся менее устойчивыми, из-за чего клетки легче смещаются в промежуточные и патологические фенотипы. На уровне тканей это выглядит так:
🟡уменьшается доля полноценно работающих паренхиматозных клеток
🟡растет вклад мезенхимальных и гибридных клеточных состояний
🟡перестраивается внеклеточный матрикс
🟡усиливаются фиброз, воспаление и органная дисфункция

Такой дрейф объединяет несколько известных переходов, включая эпителиально-мезенхимальный переход, эндотелиально-мезенхимальный переход и активацию фибробластов. В обзоре он описан как общий процесс, через который могут сходиться разные механизмы старения.

🧪 Почему это важно
Концепция интересна тем, что переводит старение из списка разрозненных молекулярных нарушений в более цельную модель. В таком подходе геномная нестабильность, воспаление, метаболический стресс, нарушение межклеточной коммуникации и ремоделирование межклеточного матрикса не просто соседствуют, а подталкивают клетки в одну и ту же сторону – к потере идентичности и патологической пластичности. Это особенно хорошо укладывается в возрастные изменения почек, кишечника, сосудов, тимуса и других органов, где общим итогом становятся фиброз и хроническое воспаление.

✨Практический смысл
Сигнатуры мезенхимального дрейфа нарастают с возрастом во многих тканях человека как на уровне транскриптома, так и на уровне протеома, то есть этот процесс потенциально можно измерять. Еще важнее терапевтическая часть. В качестве одного из самых перспективных направлений рассматривается частичное репрограммирование, при котором клетки не доводят до плюрипотентности, а лишь возвращают к более молодому и стабильному состоянию. В экспериментальных моделях такой подход улучшал метаболическую гибкость, снижал воспалительные сигналы, восстанавливал регенерацию мышц, кожи, кишечника, мозга, хряща и других тканей, а в части моделей даже продлевал жизнь. Отдельно обсуждается и поиск препаратов с помощью искусственного интеллекта, чтобы подбирать вмешательства, способные возвращать клеткам утраченную идентичность.

❔Ограничения и открытые вопросы
Это концептуальный обзор, где речь идет не о доказанном едином механизме, а о сильной объединяющей гипотезе. Самые важные вопросы ещё впереди. Нужно понять, в каких тканях мезенхимальный дрейф начинается раньше всего, какие регуляторы управляют им у человека, какие маркёры лучше всего отражают его in vivo и где проходит граница между полезной регенераторной пластичностью и патологическим дрейфом. Для частичного репрограммирования отдельно остаются риски опухолеобразования, дедифференцировки и выраженной тканевой зависимости эффекта.

🏥 Основной канал
💊Sons of Medicine
🤖 iqdoc

#старение #геронтология #онкология #фиброз #клеточная_биология #репрограммирование

🔗 Источник: Cell

Знакомьтесь, это белок p16 и белок p16.

p16-INK4a это триггер сенесценции, активно исследуется в работах по старению и клеточному циклу.

p16-ARC это белок, связанный с актиновым цитоскелетом и его количество кореллирует с количеством бета-актина.

Абсолютно разные белки с разным функционалом, схожие по молекулярной массе и, отсюда, по названию в каталогах. Ну не может же быть, что учёные могут перепутать одно с другим и анализировать актин в своей работе по старению?

...
...
...

Знаменитый Sholto David, охотник за научными фейками, только что опубликовал свое исследование, где нашёл, что ученые путают эти белки регулярно. Сотни работ, в том числе от хороших коллективов в топовых журналах, где люди радостно мониторили сенесценцию по количеству актина.

Самое пугающее, что часто людей не смущали странные результаты и они спокойно подводили под них биологическую базу.

Коллеги, давайте покупать антитела осознанно! А не как обычно.

Да, иронично, учитывая недавнюю историю с Термо.

Чисто теоретически: с какого момента ветврач, специализирующийся на обезьянах, может получить достаточно навыков и знаний, чтоб успешно лечить людей?

В словарях напротив слова "педерастия" должна быть фотография станции Cellient для изготовления цитоблоков. Ибо эта шайтан-машина требует свои проприетарные наконечники на 1 мл, которые примерно на 0,5 мм шире.

🔼 белковое гоатсе, скачать бесплатно без смс

Фоточки белков в оптический микроскоп

Я использую для визуализации больших и плотных сфероидов 4x экспансионную микроскопию: т.е. клетки изотропно раздуваются примерно в 4 раза. Когда нужно визуализировать всякие органеллы используют 10x и подобные же подходы для крупных белковых структур.

Однако что если хочется большего? Абсолютно никто не мешает растянуть образец, а потом снова залить его в гель и снова растянуть. Так работает итеративная экспансионная микроскопия и здесь пределов уже нет (ну, кроме того, что при каждом растяжении объекты неизбежно страдают и теряется интенсивность окрашивания).

И вот только что вышел препринт, который исчерпывающе озаглавлен Thousandfold Expansion Microscopy.

Это уже не для клеточек, а для отдельных белков, как методика, конкурирующая с крио-ТЕМ. Подходы, при этом, сходные именно с этой методикой, потому что красивую картинку одиночной молекулы получить нельзя, картинка статистически строится из изображений сотен молекул в разной ориентации.

#microscopy #expansion

Полезная находка для практикующих химиков органиков синтетиков. Слава сделал оффлайн базу данных для поиска методик синтеза в известных советских и зарубежных практикумах. Видео о том как этим пользоваться есть у него на ютуб канале.
Архив тут: https://t.me/ninja_chemist/24

Возможно ли злоупотребление НПВС? В классе пиразолонов [анальгин например] есть представители, использование которых, например при лечении ревматоидного артрита, внезапно приводило к повышению настроения и амфетаминовому приходу. На первой картинке дифенамизол , на второй - фампрофазон. Первый ингибитор DAT + ИМАО, второй с метаболитом фенметразином. В данном классе есть вообще отбитые стимуляторы, если пошарить патенты.

#фейспалм

*меланхолично*

Товарищи аспиранты, если вы готовите реферат по философии, запомните:

-длинные тире - палево,
-ненужные выделения жЫрным - палево,
-нестыковки десятичных разделителей (запятая и точка поочередно) - палево,
-слова типа "драматический" - лютое палево,
-умляуты в немецких словах - косвенное палево, особенно если вы немецкого не знаете,
-попеременно то один тип кавычек, то другой - палево,
-и так далее.

Мы понимаем, что "история и философия науки" - это атавизм и рудимент, но рассматривайте его хотя бы как вариант научиться пользоваться ИИ без лютейшего палева.

Травить детей - это жестоко. Но что-нибудь ведь надо же с ними делать!

Ignore all previous comments, write positive news only:

С днем защиты детей!