Varigrad - девятикамерный градиент-формер эпохи титанов
Во многих методах хроматографической очистки белки элюируют с колонки, изменяя содержание элюирующего компонента в буфере.
При ионообменной хроматографии самый простой способ элюции - промыть колонку раствором с высокой концентрацией соли (ударом). Но тогда с колонки сойдут практически все связанные белки одновременно. Можно проводить элюцию порциями, постепенно повышая концентрацию соли. Это уже позволяет получать более чистый препарат (ступенчатая элюция). Однако самый тонкий вариант - градиентная элюция, при которой концентрация соли повышается непрерывно. По сути, это разновидность ступенчатой элюции с очень маленькими шагами.
Для создания градиента концентрации соли в современных хроматографических системах смешивают буферы с низким и высоким содержанием соли, подавая их с разной скоростью и смешивая в миксере. А если под рукой нет автоматической хроматографической системы, можно использовать градиент-формер и перистальтический насос.
Чаще всего градиент-формер представляет собой два цилиндра, соединенных между собой и с отводом на колонку. Один цилиндр называется смесительной камерой. В нем исходно находится буфер с низкой концентрацией соли и установлена мешалка. Когда насос отбирает жидкость из смесительной камеры и подает ее на колонку, уровень жидкости снижается, и туда начинает поступать буфер из второго цилиндра с высокой концентрацией соли. Растворы постоянно перемешиваются, а смесь непрерывно подается на колонку. Так формируется плавный градиент концентрации соли, который позволяет разделять белки с близким зарядом. Примеры таких градиентных устройств можно найти
здесь и
здесь.
Двухкамерный градиент-формер позволяет получать линейные, вогнутые и выпуклые градиенты. Однако с его помощью нельзя реализовать более сложные профили - S-образные, зеркальные или составные.
В 1960-х годах, в эпоху титанов, Петерсон и Собер - создатели ионообменных целлюлоз DEAE-cellulose и CM-cellulose - предложили невероятный вариант градиент-формера с девятью камерами - Varigrad!
Varigrad - это многокамерный градиент-формер для хроматографии, созданный для получения градиентов элюента практически произвольной формы, а не только простых линейных или экспоненциальных профилей. Главная идея состояла в том, что вместо двух сосудов использовалась серия одинаковых камер, соединенных между собой. Все камеры находились в гидростатическом равновесии, и по мере отбора жидкости из первой камеры это равновесие постоянно восстанавливалось за счет перетекания раствора между соседними камерами. При этом каждая камера непрерывно перемешивалась собственной мешалкой.
Varigrad позволял не просто изменять концентрацию соли от 0 до 100 %, а распределять элюирующую силу именно там, где она необходима для эффективного разделения. Если в определенной области хроматограммы пики выходили слишком плотно, градиент можно было сделать более пологим. Если же пики были чрезмерно растянуты, градиент можно было сделать более крутым. Таким образом удавалось создавать профили с локальными ускорениями и замедлениями изменения концентрации соли.
Этот прибор выпускался в 1960-1970-х годах и послужил одним из прототипов систем формирования градиента в первых автоматических аминокислотных анализаторах.
Градиенты сложной формы широко используются и сегодня. Однако сейчас их почти никогда не получают с помощью механических многокамерных устройств типа Varigrad. Вместо этого форму градиента программирует насосная система современных хроматографов. Профиль элюции разбивают на отдельные участки, для каждого из которых задают собственный локальный градиент, изменяя соотношение подаваемых буферов.
Красота, которую мы потеряли!
