Докторские байки

Сефадекс как аффинный сорбент

Удивительное - рядом! Сорбенты семейства сефадекс (Sephadex) производства легендарной фирмы Pharmacia чаще всего используются для гельфильтрации - разделение биомолекул по размеру. Есть и ионообменные сефадексы (Sephadex A50/A25 С50/С25) - но их сейчас применяют значительно реже.

Но, оказывается, сефадекс G50 можно использовать и для аффинной очистки важного для хроматографии гликопротеинов лектина - конкавалина А! Причем без всякой модификации. Сефадекс - это кросс-сшитый полимер декстрана и практически целиком состоит из множества остатков альфа-D-глюкозы. А конкавалин А способен специфически связывать остатки альфа-D-глюкозы и альфа-D-маннозы.

Получают конканавалин А (ConA) из семян растения Canavalia ensiformis (Jack bean). Значит, для очистки конкавалина А нужно всего лишь экстрагировать белок из порошка семян, осадить сульфатом аммония и дочистить на сефадексе G50.

А конкавалин А в хозяйстве очень полезный белок - если пришить его к носителю можно получить аффинный сорбент для очистки гликопротеинов.

На озоне с появлением китайских продавцов, наконец, стали доступны семена Canavalia ensiformis. Теперь добывать конкавалин А стало еще проще!

P.S. Прикрепляю описание очистки из замечательной книги Tijssen, P. (1985) Practice and theory of enzyme immunoassays.

Вся очистка - в таблице

При очистке белков обычно ведут таблицу очистки, которая позволяет оценить эффективность каждого этапа по выходу, чистоте и степени обогащения целевого белка. К сожалению, во многих дипломных работах и даже диссертациях, где описана очистка белков, такие таблицы не приводятся.

Какие параметры указывают в таблице очистки ферментов или белков с измеряемой биологической активностью:

Объем раствора.
Общий белок. Его можно определить колориметрическими методами: Лоури, Брэдфорд, BCA-assay. Определение концентрации по A280 на начальных этапах очистки нецелесообразно, поскольку присутствует слишком много мешающих компонентов.
Общая активность. Для ферментов активность измеряют в единицах активности. Для некоторых ферментов можно сразу определить и количество активного белка. Например, для трипсина можно провести титрование активного центра и установить зависимость между активностью и количеством трипсина.
Если белок обладает измеряемой биологической активностью, ее выражают в биологических единицах активности, основанных на функциональном тесте (EC50, IC50, биологическая активность, нейтрализующая активность).
Удельная активность. Это самый важный показатель степени очистки фермента. Рассчитывается как отношение общей активности к общему количеству белка. Чем выше удельная активность, тем чище препарат.
Выход, %. Показывает, какая доля целевого белка сохранилась после данного этапа очистки. Рассчитывается как отношение общей активности на данном этапе к общей активности исходного лизата.
Степень очистки. Показывает, во сколько раз увеличилась удельная активность по сравнению с исходным материалом.

Таблицу очистки проще строить, если белок обладает какой-либо биологической активностью. Но если белок не является ферментом и не проявляет измеримую активность, классическая колонка «удельная активность» уже теряет смысл. В этом случае вместо параметров активности используют показатели чистоты.

Самый простой и распространенный способ определения чистоты — денситометрия SDS-PAGE гелей (в Bio-Rad Image Lab это делается очень просто). Также можно использовать капиллярный электрофорез или ВЭЖХ (HPLC).

Таблица очистки является аналогом баланса материального потока в химической технологии. Такая таблица позволяет оценивать эффективность отдельных стадий и всего протокола в целом, выявлять узкие места, сравнивать различные протоколы и оценивать воспроизводимость методики.

Энжойте и чистите белочки эффективно и воспроизводимо!

Водка без лабы - деньги на ветер!

Водка в лабе - вещь полезная, и для банкета, и для отмывки гелей годится.

А в ТГ канале Лаба дорогого брата автор поделился опытом, как они использовали водку в качестве реакционной среды. Что добру продпадать!

Когда б вы знали, из какого сора растут статьи, не ведая стыда

Спойлер: статья из скриншота вовсе не про химию!

Разве для публикации статьи всегда нужны эксперименты? Вовсе нет! Ловите лайфхак: просто описываете клинический случай, когда пациент приняв водку пассатижами выдрал у себя зуб. И статья в кармане!

Хочешь сеять - отломи кончик пипетки!

Когда я учился на биофаке, в микробиологических лабах можно было увидеть стеклянные пипетки с отломанными кончиками. Не из-за неаккуратности студентов, а для удобства посева. В те времена в ходу был mouth pipetting и широкое отверстие пипетки значительно облегчал процесс. А уменьшением точности дозирования можно было пренебречь.

Сейчас, я думаю, такой подход уже в прошлом и это славно!

Волосы это не только ценный мех, но и цистеин для ваших багетов

Посещая парикмахерскую я думаю про китайский биотех прошлых лет.

Исторически в Китае человеческие волосы использовали как одно из видов кератинового сырья для получения цистеина. Человеческие волосы примерно на 90% состоят из кератиновых белков. Кератины волос богат цистеиновыми остатками, значительная часть которых соединена дисульфидными связями и представлена в форме аминокислоты цистина. Из килограмма волос можно извлечь 50-100 г цистеина. И все это богатство в наших краях попадает в отходы!

Чтобы извлечь цистеин из кератина его вначале нужно гидролизовать в соляной кислоте, осадить и перекристаллизовать, осветлить активированным углем и выделить цистин, а потом восстановить цистин и получить цистеин. Процесс довольно грязный, требует большого расхода кислот и солей и создает много отходов. Поэтому сейчас постепенно вытесняется биотехнологическими методами.

А при чем же здесь багеты? Дело в том, что цистеин широко применяется в хлебопечении. Цистеин выступает как восстановитель и частично разрывает дисульфидные связи между молекулами клейковины (глютена). Тесто становится мягче, проще раскатывается - это облегчает машинную обработку. Особенно это полезно для стандартизации свойств муки с разным содержанием глютена.

Цистеин также применяют как предшественник пищевых ароматизаторов. При нагревании цистеин реагирует с восстанавливающими сахарами (реакция Майяра). А это - запах жаренного лука и мяса и другие приятные ароматы.

В Евросоюзе цистеин из человеческих волос запрещен из-за этических причин и рисков безопасности. Раньше в Китае цистеин из волос применялся для получения цистеина для пищевой промышленности, но с 2016 года среди разрешенных источников цистеина значатся только гидролизаты шерсти животных и перьев птиц. Человеческий волосы как источник цистеина сейчас явно не разрешены, но для других целей-то использовать не запрещено! Несмотря на недостатки сырья (трудности с прослеживаемостью и сертификацией, доп. расходами на очистку) кератин волос все еще остается ценным источником для получения цистеина.

А уж в постапокалипсисе цены не будет!

Источник фоток олдовых лабораторных девайсов

Недавно читая олдовую книгу по биохимическим методам наткнулся на фотографию устройства для нарезания гелей фирмы Био-Рад. Про похожее самодельное устройство из МГУ я уже писал. Фотка в книге была плохого качества, на сайте этот прибор уже нельзя найти, он очень древний.

И тут я вспомнил про отличный источник фотографий винтажных лабораторных приборов. На помощь пришел eBay! Там продают много лабораторных прибор разных эпох, в том числе очень древние. И можно достать фотки приличного качества в разных ракурсах.

На фото - устройство для нарезания гелей для последующей детекции радиоизотопов. Меченые белки разгоняются, гель разрезается и определяется радиоактивный сигнал.

Энжойте!

Зебра в роторе!

А вы замечали концентрические полоски на донышке роторов для ультрацентрифуг? Задумывались ли для чего они?

А нужны они для решения двух задач - для того, что ультрацентрифуга узнавала ротор и для определения скорости вращения ротора.

На современных бекмановских центрифугах есть целых три датчика определения скорости вращения. Первая - это определение скорости вращения ротора при помощи инфракрасного датчика, который как раз считывает по частоте прохождения темных полосок. В старые времена для этого использовали стробоскопы, а сейчас - инфракрасные датчики. Поэтому, если полоски поцарапать, то центрифуга может выдать ошибку.

Два других датчика - это датчики Холла. Один считывает частоту вращения ротора по магнитам, которые находятся под этим кольцом с полосками. А второй - считывает частоту вращения вала, на который вешают ротор. И если все три значения скорости совпадают, значит работает исправно.

Теперь вы знаете, для чего зебра на роторе ультры, энжойте!

Пока вы жалуетесь, что МСК мало выделяются, тут их контейнерами возят!

Имитация стерильности

И еще про горелку - когда случается популяризация, в пламени горелки можно обжигать пластиковые наконечники.

Из канала некого Репича в запрещенной соцсети.

Как Бунзен не позволил мухе испортить эксперимент

В середине августа вышла статья американских ученых, в которой они подвергают сомнению способность горелки Бунзена обеспечивать стерильность при пересеве микроорганизмов. Как водится, все это быстро разлетелось по твиттеру и всяким запрещенным соцсетям. Но, сдается мне, авторы просто не умеют пользоваться горелкой.

А сам Роберт Бунзен был очень интересным ученым и героем многих курьезных историй. Он был известен своей педантичностью и требовательностью к точности экспериментов. Однажды он определял содержание бериллия в образце руды. После длинной серии химических превращений все свелось к самому важному этапу: взвешиванию небольшого количества осадка на фильтре. Именно от этой массы зависел результат анализа.

И тут случилось непредвиденное. На фильтр села муха, собрала на лапки часть драгоценного порошка и улетела. Увидев это, Бунзен издал такой крик, что в лабораторию сбежались студенты. Муху быстро поймали и принесли профессору. Бунзен поместил насекомое в платиновый тигель, сжег его, выделил из золы оксид бериллия, который муха успела похитить, и после взвешивания вернул потерянное вещество в расчеты. Эксперимент был спасен!

Будьте внимательны и не пускайте мух в лабу! Ну или, по крайней мере, набирайте ловких студентов!

Для чего в кофе-машину заливать ацетонитрил вместо воды?

Представьте: ученый приходит в лабораторию и заливает в кофе-машину не чистую воду, а 40% раствор ацетонитрила.

Нет, это не сюжет фильма ужасов про психопата, которому осточертели коллеги, а обычный рабочий день ученого-аналитика, которому нужно быстро и дешево экстрагировать аналиты из образцов почвы, растений или продуктов питания.

В 2016 году испанский ученый Sergio Armenta с коллегами в статье Hard Cap Espresso Machines in Analytical Chemistry: What Else? описал использование обычной эспрессо-машины для экстракции полициклических ароматических углеводородов из образцов почвы и донных отложений. Позже появились работы, в которых с помощью кофе-машин экстрагировали фарм препараты из почв, капсаицин из перца чили и другие биоактивные вещества из растений (в том числе и те самые из тех самых растений).

Сравнительные эксперименты показывают, что кофе-машина все же не дотягивает до возможностей специализированных приборов. Однако своя ниша у нее есть: это дешево, быстро и достаточно эффективно для решения ряда аналитических задач. В первой работе экстракция занимала всего 11 секунд, а результаты были сопоставимы с референсными методиками.

Энжойте и успешных экстракций!