Глыба белка или аффинный сорбент без носителя

Для очистки специфических антител можно ковалентно иммобилизовать антиген на частицах сорбента и получить аффинный сорбент. О методах активации я рассказывал ранее тут и тут. Такой подход сейчас является самым распространенным и хорошо отработанным.

Но в давние времена, до появления удобных сефарозных носителей, практиковали другой способ - превратить в аффинный сорбент сам антиген!

Для этого нужно было перевести белок в нерастворимое состояние, сохранив способность специфически связывать антитела. Одним из самых популярных способов была полимеризация белка глутаровым альдегидом. В статье S. Avrameas (1969) авторы тщательно протестировали влияние условий реакции на разные белки для получения аффинных сорбентов непосредственно из белковых препаратов. Такие частицы не разваливаются в мочевине или в SDS и их можно использовать для хроматографии.

Основные выводы:
1. pH реакции лучше всего выбирать вблизи pI белка.
2. Хорошая отправная точка: 5-10 мг глутарового альдегида на 100 мг белка.
3. Концентрация белка имеет значение - лучше использовать концентрированные растворы (20-50 мг/мл).
4. После образования геля реакционную смесь стоит инкубировать еще 1-3 часа.
5. Некоторые белки плохо сшиваются из-за малого количества доступных аминогрупп. В таких случаях помогает добавление БСА.

Такие аффинные сорбенты можно применять в объеме (batch): измельчить, отмыть и смешать с иммунной сывороткой, затем осадить, снова отмыть и элюировать связавшиеся антитела. А можно организовать и настоящую колоночную очистку! Небольшой недостаток - процесс очистки занимал 6-8 часов, дольше, чем на современных носителях. Но в статьях тех лет отмечается, что чистота получаемых препаратов антител была высокой, а сорбент можно было использовать повторно.

Так что если в постапокалипсисе в пустошах закончится сефароза, аффинный сорбент можно будет сделать и без нее!

Энжойте!

P.S. Прикрепляю протокол по получению аффинного сорбента из книги "Иммуносорбенты в очистке белка" 1979