Как синтезировать аффинный сорбент. Эпокси активация матрицы

Продолжение постов про получение аффинных сорбентов (начало - тут).

Эпокси активация сефарозы - это классический способ активации , при котором на поверхности матрицы формируются эпоксигруппы, способные к ковалентному связыванию лигандов. Я активировал эпихлогидрином, простым и доступным эпокси-реагентом. Еще круче - активировать бис-оксиранами (1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир), но он дороже. Руслан @Biophyschem рассказывал, что успешно использовал для активации технический 1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир купленный на озоне - она используется как разбавитель эпоксидной смолы.

После активации на сефарозе появляются эпоксигруппы, которые могут реагировать с аминными, тиольными и гидроксильными группами лигандов, что делает метод универсальным по сравнению с CNBr. Если вы беспокоитесь о токсичности BrCN - эпоксиактивация отличная альтернатива.

Преимущества этого метода:
1. Менее токсичные реагенты, по сравнению с BrCN
2. Можно связывать не только по аминогруппам, но и по тиолам и даже гидроксилам (всего-то нужно поменять pH конъюгации)
3. По сравнению с BrCN активацией связь гораздо прочнее, практически отсутствует утечка лиганда. Проще повторно использовать.
4. Связь образуется через гидрофильный спейсер, в случае эпихлоргидрина это три атома углерода, если брать диглицидиловые эфиры -от 6 до 12!
5. Активированный сорбент можно хранить и использовать позднее.
6. Не остается заряженных групп.

Недостатки тоже есть:
1. Реакция иммобилизации происходит в щелочных условиях, не всем белкам может подойти
2. Активация проходит дольше
3. По моему опыту - как будто бы емкость получается ниже, чем в случае BrCN
4. Эпокси реагент помимо активациии сорбента может и участвует в кросс-сшивке, с уменьшением пористости микросфер.

Для проведения эпоксиактивации я использовал метод, описанный в статье Matsumoto (1979). В замечательной книге Hermanson на стр. 691 также есть протокол (но без DMSO и более долгий). Если кратко - сефарозу ресуспендируют в смеси 0,4M NaOH и DMSO, добавляют эпихлоргидрин и оставляют активироваться на 2 ч при температуре 40С. Потом остается только отмыть, добавить белок в щелочном буфере и проинкубировать. После конъюгации сорбент нужно отмыть и заблокировать оставшиеся эпокси группы и снова отмыть. Неиспользованный активированный сорбент можно хранить в воде с консервантами в холодильнике.

Энжойте и получайте аффинный сорбент просто!