Как синтезировать аффинный сорбент. Активация матрицы

Для ковалентной иммобилизации белков матрицу необходимо предварительно активировать. Методов активации очень много, подробнее можете почитать в рекомендованных книгах (+ Остреман). Ниже приведены основные принципы и практические моменты для метода активации бромцианом, без избыточной детализации условий реакции. Материал предназначен только для специалистов и носит ознакомительный характер. Буду рад, если в комментариях поделитесь своими лайфхаками и советами про активацию сорбентов.

Активация бромцианом
CNBr активация сефарозы является классическим быстрым методом, разработанным в 1960х годах сотрудниками компании Pharmacia. В щелочной среде бромциан реагирует с -OH группами агарозы и образует реакционноспособные промежуточные структуры, преимущественно эфиры цианатов и производные имидакарбоната. Эти группы легко взаимодействуют с аминогруппами белков, в результате чего формируется ковалентная связь. Метод отличается высокой скоростью и удобством, однако имеет ряд ограничений: используется токсичный реагент, активированные группы нестабильны и должны использоваться сразу после получения, формируемая связь может вносить дополнительный положительный заряд, а сама реакция не является строго сайт специфичной, что иногда влияет на активность белка. Изомочевинная связь нестабильна при низких pH и со временем колонка начинает подтекать (после эпокси-активации связь гораздо стабильнее).

Важно! Соблюдайте технику безопасности! Все операции с бромцианом проводят строго в вытяжном шкафу, так как реагент токсичен и летуч. Растворы после реакции также остаются токсичными. Для их нейтрализации и обработки посуды используют щелочной раствор с добавлением сернокислого железа, например 0.5 M Na2CO3 с добавлением примерно 50 мМ FeSO4, выдерживая около 15 минут.

На практике сефарозу ресуспендируют в холодном буфере с высоким pH. Буфер следует выбирать без аминогрупп. Перемешивание предпочтительно проводить с использованием верхнеприводной мешалки, так как мешальник магнитной мешалки может механически разрушать гранулы матрицы. Для активации требуется pH порядка 9-10 и охлаждение. В ряде работ рекомендуют контролировать pH с помощью pH метра и корректировать его щелочью, однако более удобным является использование концентрированного карбонатного буфера. Например, в работе March (1974) предложено проводить реакцию в 2 M растворе карбоната натрия, который обеспечивает достаточно высокий pH и буферную емкость без необходимости постоянного контроля. В таких условиях к сефарозе добавляют реагент для активации и проводят активацию в течение 1-2 минут. После этого матрицу быстро переносят на фильтр Шотта и последовательно промывают холодным щелочным буфером, водой и буфером, предназначенным для последующей коньюгации. Сефарозу слегка подсушивают на фильтре, затем переносят в подходящую пробирку, добавляют белок в буфере и проводят иммобилизацию при перемешивании при +4 C в течение нескольких часов, часто оставляя на ночь. После завершения реакции сорбент тщательно отмывают и оценивают эффективность иммобилизации.Далее блокируют оставшиеся активные центры и все, можно работать!

Важные моменты

1. Стандартные лопатки мешалок часто слишком велики для небольших объемов, поэтому удобно изготовить компактный вариант,например из пластикового шпателя Дригальского.
2. Охлаждать можно, добавляя лед в реакционную смесь (при больших объемах).
3. Дин (1988) указывает, что Трис использовать можно, так как аминогруппа экранирована.
4. Бромциан лучше вводить в виде раствора в ацетонитриле, что повышает воспроизводимость и удобство работы; такой раствор можно хранить при температуре около -70 C. Для оценки эффективности иммобилизации можно использовать качественное окрашивание кумасси, а также количественные подходы, например измерение оптической плотности суспензии в глицерине. Часто применяют оценку по содержанию несвязавшегося белка в супернатанте и промывках, однако этот метод не всегда дает точную картину.
5. Блокировать можно глицином, этаноламином, гидроксиламином.