Продолжаем разговор о рутине клинического интерпретатора. Чаще всего от биоинформатиков прилетают две таблички. Первая — с SNV и инделами, с ней всё ясно-понятно. Вторая — со структурными вариантами, а это история куда менее очевидная.
По определению к структурным вариантам (SV) относят любые изменения не менее 50 bp. Прежде всего, конечно, все вспоминают о CNV. Это вариации числа копий, то есть делеции или дупликации. Также к группе принадлежат инверсии, инсерции, транслокации и всякие умопомрачительные комплексные перестройки. Так, в 2020 году описали экстремально запутанную штуку с семью хромосомами и 49 точками разрыва. Причем у здорового человека!
Структурные варианты встречаются реже, чем SNP и индели, но благодаря своему размеру затрагивают значительно бо́льшую часть генома и могут иметь более серьезные последствия для фенотипа. Так, SV связывают с нарушениями нейропсихического развития. Давно известны микроделеционные синдромы — Ангельмана, Ди Джорджи, Смит–Магенис.
Традиционно для обнаружения и подтверждения SV используют такие молекулярно-генетические техники, как aCGH, MLPA, qPCR, FISH. NGS же не считается референсным методом из-за ограничений, вызванных короткими ридами. Но алгоритмы для коллинга CNV и даже других структурных вариантов в данных высокопроизводительного секвенирования существуют и работают. Тут надо упомянуть четыре биоинформатические идеи:
1. Покрытие. В основе — очевидная мысль, что систематическое падение/рост покрытия может указывать на делецию/дупликацию. При наличии выборки контрольных образцов (что снижает техническое смещение) для коллинга годится и экзом, хотя достоверность ниже. По покрытию можно ловить только CNV.
2. Сплит-риды. Это когда часть рида картируется на одно место, а второй кусок — на другое. Важно, что невыровненный хвост рида не удаляется из данных, а помечается как софтклип. По сплит-ридам можно находить разные события и устанавливать границы разрыва (breakpoints) с точностью до нуклеотида.
3. Дискордантные пары. По смыслу похоже на сплит-риды, но касается уже двух ридов при парноконцевом секвенировании. В норме пары должны располагаться на определенном расстоянии и быть направлены друг на друга. Если нарушена ориентация прочтений или длина вставки (insert size) отличается от ожидаемой, это указывает на SV. Но места разрывов определяются примерно.
4. Сборка de novo. Наименее популярный метод. Для каждого пациента собирают полный геном. Удовольствие ресурсоемкое и неудобное на коротких ридах. Однако ситуацию способны улучшить длинные риды (lrWGS), особенно в локусах с повторами. Уже сейчас нанопоровое секвенирование применяется, скажем, для поиска транслокаций при онкогематологических заболеваниях в НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, о чем рассказали спикеры на прошлом вебинаре.
Программы для коллинга SV обычно комбинируют четыре стратегии, однако результаты разных тулов могут не пересекаться, а золотых стандартов нет. Инструменты пропускают мутации, ошибаются в границах, могут разделить один крупный вариант на несколько мелких.
Если даже умные алгоритмы не справляются, то интерпретатору что прикажете? Вообще, для структурных вариантов обязательна визуальная перепроверка в IGV, где можно настроить удобный просмотр софтклипов, парных ридов и многое другое. Что касается таблицы с вариантами — об этом подробно на курсе. Чему доверять, какие колонки аннотаций наиболее важны, в каких базах данных искать дополнительную информацию, что такое полуколичественная система оценки ACMG, как правильно именовать варианты по цитогенетической и HGVS-номенклатуре — всё это методично разбирает Светлана Жикривецкая. Если вас интересует тема и есть вопросы, добро пожаловать в эту пятницу на вебинар 🧬