Прототипом фермента послужили четыре природные ДНК-полимеразы из гипертермофильных архей, которые обладают высокой термостабильностью. Исследователи заранее ввели в эти гены две мутации для отключения экзонуклеазной активности («чтобы не съедали цепь») и четыре усиливающих мутации.
Главный трюк состоял в создании библиотеки генов: они разбили ДНК всех четырёх полимераз на 48 фрагментов и перемешали их методом гомологичной рекомбинации (ДНК-шаффлинга). В результате получилась библиотека теоретической сложностью 4¹² вариантов — каждая новая полимераза представляла собой мозаику из кусочков исходных белков.
Из миллионов вариантов учёным предстояло найти те единицы, которые смогут эффективно синтезировать РНК вместо ДНК. После нескольких раундов отбора с использованием высокопроизводительного микрофлюидного сортинга был получен фермент C28, который способен синтезировать РНК с матрицы ДНК в пять раз быстрее, чем природный аналог.
При этом фермент сохраняет активность даже после шести часов нагрева при 90°C.
Самое удивительное — кристаллическая структура показала, что структура каталитического центра фермента C28 почти не изменилась по сравнению с природной полимеразой. Все 39 приобретённых в ходе эволюции мутаций лежат далеко от активного центра, что означает, что ускорение синтеза РНК произошло не за счёт изменения структуры активного центра, а за счёт изменения дальних динамических взаимодействий в белке.
«Учитывая сложность моделирования ферментов с динамическими дальними взаимодействиями, маловероятно, что эти мутации могли бы быть идентифицированы современными вычислительными методами».
То есть авторы не просто сделали работу без ИИ — они аргументированно показывают, почему ИИ здесь был бы бессилен. Таким образом, работа Чапута показывает, что классическая направленная эволюция остаётся прекрасным методом в тех областях, где ИИ пока бессилен — для поиска непредсказуемых комбинаций дальних мутаций.
