Электрофорез действительно больших белков

Всем привычный электрофорез по Лэммли позволяет отлично разделять смеси белков в диапазоне примерно 10-250 кДа. А вот для электрофореза крупных белков, в том числе таких, как mTOR и Ki-67, эта система подходит уже хуже.

Для электрофоретического разделения высокомолекулярных белков вплоть до 500 кДа используют другую буферную систему: в геле не трис-глицин-SDS, а трис-ацетат-SDS, а в электродном буфере трис-трицин-SDS. Это позволяет «растянуть» верхний диапазон и лучше разделять крупные белки. Для еще большего разрешения гели делают градиентными.

В самом геле используется трис-ацетат-SDS с pH около 7, а в электродном буфере трис-трицин-SDS с pH 8,2. Поскольку pH геля близок к нейтральному, для поддержания восстановительных условий добавляют бисульфит натрия.

На неделе помогал коллегам заливать градиентные гели 3-15% в трис-ацетат-SDS-системе. Градиент-формер и кассета древние, биорадовские, но работают. При заливке много тонкостей: нужно подобрать объемы растворов, концентрации персульфата аммония и ТЕМЕДа, скорость подачи. Важно добиться, чтобы гель застывал достаточно быстро, примерно за 15 минут, но не настолько быстро, чтобы полимеризация началась до того, как насос успеет все закачать.

Со второй попытки все получилось: гели залились как надо, а тестовые дорожки со стандартами хорошо разошлись. Теперь осталось протестировать их на реальных образцах.