Вся очистка - в таблице

При очистке белков обычно ведут таблицу очистки, которая позволяет оценить эффективность каждого этапа по выходу, чистоте и степени обогащения целевого белка. К сожалению, во многих дипломных работах и даже диссертациях, где описана очистка белков, такие таблицы не приводятся.

Какие параметры указывают в таблице очистки ферментов или белков с измеряемой биологической активностью:

Объем раствора.
Общий белок. Его можно определить колориметрическими методами: Лоури, Брэдфорд, BCA-assay. Определение концентрации по A280 на начальных этапах очистки нецелесообразно, поскольку присутствует слишком много мешающих компонентов.
Общая активность. Для ферментов активность измеряют в единицах активности. Для некоторых ферментов можно сразу определить и количество активного белка. Например, для трипсина можно провести титрование активного центра и установить зависимость между активностью и количеством трипсина.
Если белок обладает измеряемой биологической активностью, ее выражают в биологических единицах активности, основанных на функциональном тесте (EC50, IC50, биологическая активность, нейтрализующая активность).
Удельная активность. Это самый важный показатель степени очистки фермента. Рассчитывается как отношение общей активности к общему количеству белка. Чем выше удельная активность, тем чище препарат.
Выход, %. Показывает, какая доля целевого белка сохранилась после данного этапа очистки. Рассчитывается как отношение общей активности на данном этапе к общей активности исходного лизата.
Степень очистки. Показывает, во сколько раз увеличилась удельная активность по сравнению с исходным материалом.

Таблицу очистки проще строить, если белок обладает какой-либо биологической активностью. Но если белок не является ферментом и не проявляет измеримую активность, классическая колонка «удельная активность» уже теряет смысл. В этом случае вместо параметров активности используют показатели чистоты.

Самый простой и распространенный способ определения чистоты — денситометрия SDS-PAGE гелей (в Bio-Rad Image Lab это делается очень просто). Также можно использовать капиллярный электрофорез или ВЭЖХ (HPLC).

Таблица очистки является аналогом баланса материального потока в химической технологии. Такая таблица позволяет оценивать эффективность отдельных стадий и всего протокола в целом, выявлять узкие места, сравнивать различные протоколы и оценивать воспроизводимость методики.

Энжойте и чистите белочки эффективно и воспроизводимо!