Как я подбираю праймеры для реал-тайма - гайд для начинающих (1)

Пока я разбираюсь с флуоресцентными зондами (как и положено цитометристу) и магией мультиплексной ПЦР, напишу о том, как подбираю праймеры для оценки экспрессии генов с помощью реал-тайма с SYBR Green.
Сразу оговорюсь, что у меня есть любимые сервисы и более-менее работающий алгоритм, который я сейчас и опишу. Можно найти любые другие по вкусу или исключить некоторые этапы, чтобы не было, как в анекдоте про маленькую сковородку и обрезанные сосиски.

1. Сначала нахожу нужную последовательность в Nucleotide GenBank. Поскольку мне нужна человеческая мРНК, применяю фильтры mRNA и RefSeq и организм (например, Homo sapiens).

2. В выдаче нахожу понравившуюся запись и ее ID (NM_). Выбираю нужную изоформу.

3. Далее иду в Primer Blast:
3.1. Выбираем, хотим ли мы подбирать для одной мишени или для нескольких (например, несколько изоформ) и заполняем поле с ID.
3.2. Если мы хотим, чтобы какой-то из праймером отжигался в определенном участке, то заполняем поля рядом (from & to). Еще можно ниже отметить галочку "подбирать ближе к 3'-концу", если праймер для обратной транскрипции - это oligo(dT). Если есть один из праймеров, копируем.
3.3. Моя любимая длина ампликона: 100-220.
3.4. Температура: я люблю ставить от 60-61, оптимум 62, максимум 64-65, разницу ставлю 1.5. Разные сервисы считают по-разному. Температуры от Primer Blast меня немного смущают. Я сравнивала Thermo Fisher Multiple Primer Analyzer, IDTDNA Oligo Analyzer и по UCSC In Silico PCR. Мои панели рассчитаны обычно на 64C. по последнему сервису, что обычно соответствует примерно 62C по IDTDNA.
3.5. Поскольку я обычно работаю без ДНКазы, я подбираю праймеры так, чтобы они не отжигались на геномке. Поэтому я ищу в двух режимах: "primers must span on exon-exon junctions" и "primers may not span...", но тогда ставлю галочку "разделять интроном от 1000 bp".
3.6. Если нет необходимости искать праймеры, специфичной для одной изоформы или нужно несколько, то ставлю галочку "allow to amplify splice-variants".
3.7. Галочки, какая база должна использоваться для бластования праймеров. Поскольку у меня клеточные культуры, я использую Homo sapiens RefSeq.
3.8. И еще галочка "open results in a new window" :)

4. Далее еще раз проверяю с помощью UCSC In silico PCR, есть ли отжиг на геномке (посмотреть, поднимутся ли псевдогены). На этом месте могу скорректировать праймеры на этом этапе вручную. Это уже немного пункт разряда "сковородка", но мне он значительно помогает в подборе.

5. С помощью сервиса IDTDNA Oligo Analyzer я проверяю шпильки, гомо- и гетеродимеры. Смотрю на наличие стеблей от 4 п.о., особенно на 3'-конце, и dG. Избегаю стеблей, содержащих от 4х CG-пар подряд (а возле 3'-конца стеблей от 3-4 п.о. быть не должно), и |dG| < 6 (оно же dG > -6). Если нужно, корректирую вручную.

Так подбираю 2-3 пары праймеров, затем определяю диапазон температур отжига градиентной ПЦР (60-65С) и ставлю эффективность по 4 разведениям матрицы.

В комментариях скрины.

#surrealtime #лабораторный_могул