Продолжение рассказа про микроскопию клещей. Пару слов о приготовлении и просмотре окрашенных фиксированных препаратов из клещей.
Необходимое оборудование: микроскоп со светлопольным конденсором и препаратоводителем, осветитель ОИ-19 или другой системы, предметные стекла толщиной не более 1,4 - 1,5 мм, острые ножницы, глазной пинцет. Оптимальное увеличение - x600 - x750 в системе с масляной иммерсией (объективы: x90 - x100).
Для приготовления препарата из взрослого клеща, удерживая его пинцетом, отрезают задний край тела исследуемой особи. Срез промакивают фильтровальной бумагой. Держа клеща вертикально, проводят срезом по поверхности предметного стекла, делая мазки по 2,5 - 3,0 см. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют. Наиболее простой способ - фиксация в пламени спиртовки или газовой горелки. Для этого предметное стекло (мазками вверх) трижды проводят над пламенем так, чтобы его прямое воздействие не превышало 1 - 2 сек. После этого препарат можно длительное время хранить в сухом месте при комнатной температуре. Окраску проводят общепринятым способом по Романовскому - Гимза (40 - 60 мин. в 5% водном растворе Гимза с последующим ополаскиванием и высушиванием).
Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского-Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объёмов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде. Затем препарат необходимо докрасить кристаллическим фиолетовым в течение 10 - 30 мин., после этого слегка ополоснуть под тонкой струйкой воды, быстро удалить оставшиеся капли спринцовкой (фильтровальную бумагу использовать для этого не рекомендуется) и высушить. Состав краски:
80 мл 2% раствора оксалата аммония (калия или натрия)20 мл метилового или этилового спирта 2 г красителя кристаллического фиолетового Краситель растворяют в спирте и смешивают с раствором оксалата. Полученную краску можно хранить при комнатной температуре не менее года и использовать многократно. Т.к. выцветание препарата начинается достаточно быстро, его просмотр должен быть проведен не позже чем через 2 - 3 недели после приготовления. До этого препараты нужно хранить в темноте. В случае выцветания препарата возможна его повторная докраска кристаллическим фиолетовым указанным выше способом.
При просмотре препарата поиск боррелий ведут на тонких (не более одного слоя клеток) участках мазка с таким расчетом, чтобы в каждом из двух мазков просмотреть не менее 100 - 150 полей зрения. Выполнение этого объема работы с высокой степенью вероятности гарантирует обнаружение боррелий в препарате из инфицированного клеща.
Для приготовления препарата из нимфы ее раздавливают любым тонким инструментом с зашлифованным концом и остатками клеща проводят по предметному стеклу. Обычно таким путем удается сделать лишь один мазок, который обрабатывают и исследуют как описано выше.
#DIYbio, #biosafety #ixodidae, #ticks, #lyme_disease, #biocontrol, #acarology, #microscopy
