معرفی ابزار | کمی‌سازی باندهای Western blot با Fiji - بخش اول
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
آیا نمونه‌ای که باند تیره‌تری دارد واقعاً پروتئین بیشتری دارد؟
مقایسه چشمی باندها برای نتیجه‌گیری کمی کافی نیست. نمایشگر، تنظیمات Contrast، پس‌زمینه غشا، اشباع سیگنال و حتی نحوه انتخاب محدوده باند می‌توانند برداشت ما را تغییر دهند.
ابزار Fiji نسخه‌ای از ImageJ است که مجموعه‌ای از افزونه‌های پرکاربرد تحلیل تصویر را در اختیار پژوهشگر قرار می‌دهد و می‌توان از آن برای تبدیل شدت باندها به داده‌های عددی استفاده کرد.
⚙️ ابزار Fiji چه چیزی را اندازه‌گیری می‌کند؟
در تحلیل Densitometry، مقدار سیگنال پیکسلی موجود در محدوده هر باند اندازه‌گیری می‌شود. پس از اصلاح Background، این مقدار می‌تواند برای مقایسه نسبی نمونه‌ها استفاده شود.
این تحلیل معمولاً شامل مراحل زیر است:
▫️ انتخاب ROI یکسان برای باندها
▫️ اندازه‌گیری شدت یا Integrated Density
▫️ برآورد و کسر Background
▫️ نرمال‌سازی سیگنال Target
▫️ مقایسه نمونه‌ها در محدوده خطی آشکارسازی
📌ابزار Fiji یک تصویر نامناسب را به داده معتبر تبدیل نمی‌کند. اعتبار کمی‌سازی از مرحله تصویربرداری آغاز می‌شود، نه از مرحله بازکردن فایل در نرم‌افزار.
پیش از شروع تحلیل
برای تحلیل کمی مناسب، بهتر است:
▫️ از فایل خام و ترجیحاً فرمت غیر Lossy مانند TIFF استفاده شود.
▫️ تصاویر در محدوده خطی سیستم تصویربرداری ثبت شوند.
▫️ هیچ‌یک از باندهای مورد تحلیل اشباع نباشند.
▫️ شرایط Exposure میان نمونه‌های مورد مقایسه یکسان باشد.
▫️ Background تا حد امکان یکنواخت باشد.
▫️ برای همه باندها ROIهایی با ابعاد یکسان انتخاب شود.
▫️ پردازش تصویر برای تمام نمونه‌ها یکسان و مستند باشد.
فایل‌های JPEG، تصاویر Screenshotشده یا تصاویر استخراج‌شده از PDF معمولاً گزینه‌های مناسبی برای کمی‌سازی دقیق نیستند؛ زیرا ممکن است فشرده‌سازی، تغییر کنتراست یا کاهش اطلاعات تصویر در آن‌ها رخ داده باشد.
مسیر پایه تحلیل در Fiji
1️⃣ فایل خام را در Fiji باز کنید.
2️⃣ در صورت نیاز، نوع تصویر را بررسی کنید:
Image > Type
3️⃣ تصویر را فقط برای سهولت مشاهده معکوس کنید؛ این کار نباید اطلاعات خام را حذف یا اشباع کند:
Edit > Invert
4️⃣ با ابزار Rectangle یک ROI با اندازه مشخص در اطراف هر باند انتخاب کنید.
5️⃣ همان ROI را بدون تغییر اندازه روی تمام باندهای قابل‌مقایسه اعمال کنید.
6️⃣ شدت باندها را با ابزارهای Measurement یا Gel Analysis استخراج کنید:
Analyze > Gels
یا
Analyze > Measure
7️⃣ پس زمینه (Background) را با روشی یکسان برای همه Laneها برآورد و اصلاح کنید.
8️⃣ سیگنال اصلاح‌شده Target را بر Loading control مناسب تقسیم کنید.
یک شکل ساده از محاسبه:
Corrected signal = Band signal − Backgroundسپس:
Normalized target = Corrected target / Corrected loading control📌 مقدار Background باید با روش ازپیش‌تعریف‌شده و در ناحیه‌ای نماینده از پس‌زمینه همان باند یا Lane اندازه‌گیری شود. تغییر دلخواه محل Background بین نمونه‌ها می‌تواند نتیجه را منحرف کند.
در بخش دوم (پست بعدی): انتخاب روش نرمال‌سازی، کنترل‌های ضروری و قواعد گزارش دنسیتمتری
#Tech_Radar #Western_Blot
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
@Connectosome