​Редакция Nature Biotechnology сравнила четыре способа записи ДНК и назвала изготовление длинных точных последовательностей узким местом

19 августа редакционный обзор журнала Nature Biotechnology сопоставил четыре подхода к записи ДНК. Он объясняет, почему создание длинных точных последовательностей тормозит путь от компьютерного дизайна к лабораторной проверке биологической идеи.

Компьютерные модели за часы предлагают тысячи вариантов белков и генетических конструкций. Чтобы проверить любой из них, лаборатории сначала нужно получить его последовательность ДНК и убедиться в её точности. На этой физической стадии цикл от проекта к эксперименту становится медленным и дорогим.

Промышленный стандарт — фосфорамидитная химия. Она добавляет нуклеотиды, химические «буквы» ДНК, по одному и создаёт короткие фрагменты — олигонуклеотиды — длиной примерно до 200 нуклеотидов. Из таких фрагментов затем собирают длинную последовательность. Сотни химических циклов накапливают ошибки, а сборка не может исправить ошибку в исходном фрагменте.

Методы Sidewinder и MOSAIC работают именно на этапе сборки. Sidewinder задаёт порядок соединения третьей нитью ДНК, которая остаётся за пределами готовой молекулы; это помогает собирать повторяющиеся последовательности. В MOSAIC перекрывающиеся олигонуклеотиды самособираются в одной реакции, затем клеточная система ремонта ДНК заделывает разрывы и превращает заготовку в плазмиду — кольцевую молекулу ДНК для генной инженерии.

Собранную конструкцию ещё размножают в клетке. Быстрый рост бактерии Vibrio natriegens сокращает этот этап клонирования. Рассматриваемый обзор ставит проблему раньше: перед размножением длинную ДНК нужно написать и собрать с приемлемой точностью.

Другой путь меняет саму запись. TdT — фермент, который добавляет заданные нуклеотиды по одному без ДНК-матрицы; обзор приводит результат Ansa Biotechnologies: молекулы длиннее 1 000 оснований. Ретроны — бактериальные генетические элементы — несут РНК-шаблон и обратную транскриптазу, которая копирует РНК в ДНК. В описанных экспериментах ретроны создавали последовательности длиной в десятки пар оснований.

Четыре ветви снимают разные ограничения: привычная химия делает фрагменты, Sidewinder и MOSAIC соединяют их, TdT пишет последовательность напрямую, ретроны задействуют клетку. Темп экспериментального цикла зависит от того, удаётся ли совместить достаточную длину, точность и скорость на всех этих этапах.

Для белков, спроектированных с помощью ИИ, срок до эксперимента складывается из изготовления и проверки ДНК. В генной и клеточной терапии длинные точные последовательности нужны для конструкций с несколькими генетическими правками и крупными вставками ДНК. Новые методы придётся сопоставлять на последовательностях разной длины и сложности: так можно сравнить их скорость, точность и надёжность.