💠آزمایش PCR
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز که به اختصار(PCR)   مخفف Polymerase Chain Reaction  خوانده میشود،یک روش متداول آزمایشگاهی است که  اصول کار آن،تکثیر قطعه مشخصی از DNA است. در این روش،با هیچ محدودیتی در انتخاب قطعه هدف  مواجه نیستیم و می تواند شامل کل  یا قسمتی از ژن‌های رمزکننده پروتئین،RNA یا قسمتی از یک زیست نشانگر باشد که جهت احراز هویت در پزشکی قانونی اهمیت دارد.
بنابراین،‌هدف از PCR ایجاد تعداد کپی‌های فراوان از ناحیه ی هدف است. در مرحله ی بعدی،این کپی‌ها جهت مطالعه، بررسی،تجزیه و تحلیل خصوصیات و یا مراحل مختلف کلونینگ و دیگر موارد مانند تعیین توالی، انتقال به ژل الکتروفورز و درج در پلاسمید مورد استفاده قرار می گیرد.
به همین علت تکنیک PCR در وجوه مختلف علمی مانند زیست شناسی مولکولی،تشخیص پزشکی و نیز در گروه هایی از اکولوژی کاربرد بسیاری دارد.

🔹اجزای اصلی تست PCR
از اجزای اصلی یک واکنش PCR  می توان به موارد زیر اشاره کرد :
آنزیم Taq پلیمراز
پرایمرها
الگو(DNA)
نوکلئوتیدها(dNTP)
بافر
این موارد همگی در یک تیوب کوچک، جمع شده  و در مرحله ی بعدی،یک چرخه ی پی در پی از گرمایشی و سرمایشی مکرر، منجر به بوجود آمدن میلیون ها کپی از DNA هدف می شود.

🔹آنزیم Taq پلیمراز
اساس کار واکنش  PCR نیز مانند پروسه ی همانندسازی DNA،بر مبنای آنزیم DNA پلیمراز است.آنزیم Taq  پلیمراز، رشته جدید DNA  را از روی DNA الگو کاتالیز می کند. این آنزیم از باکتری ترموس آکواتیکوس که مقاوم به گرما است،گرفته می شود.محل  زندگی این باکتری ها در چشمه‌های آب داغ و دریچه‌های گرمابی است. از آنجا که این دریچه‌های گرمایی در عمق دریا و اقیانوس و در نزدیکی جایگاه ‌های فعال آتشفشانی قرار داشته و نیز محل خروج هوای گرم هستند،از این رو آنزیم‌های این باکتری،از جمله DNA پلیمراز، نسبت به گرما پایداری بالایی دارند. به گونه ای که فعال ترین حالت این آنزیم در دمای 70 درجه سانتیگراد است.باید توجه داشته باشید که در این دما بیشتر آنزیم‌های انسانی،غیرفعال می شوند.

🔹پرایمرهای PCR
آنزیم Taq پلیمراز فقط در حضور پرایمر توانایی سنتز رشته جدید را دارد.در واقع پرایمرها،اولیگونوکلئوتیدهایی از جنس DNA هستند که سر OH آزاد را در اختیار آنزیم قرار می دهند و یک نقطه آغاز را در برای آن تعیین می کنند. به عبارت دیگراین نقطه شروع،همان گروه هیدروکسیل آزاد موجود در انتهای 3′آخرین نوکلئوتید مولکول پرایمر می باشد. پرایمرهای لازم در واکنش زنجیره‌ ای پلیمراز (PCR) قطعه‌های کوتاهی از یک DNA تک رشته‌ای هستند که عموما طولی در حدود 20 نوکلئوتید دارند. طراحی این قطعات به گونه ای است که ناحیه هدف را در بر بگیرند. بنا براین در هر واکنش  PCR،دو پرایمر جهت اتصال به هر یک از دو رشته ی DNA لازم است  و این اتصال به وسیله پیوند هیدروژنی بین پرایمر و DNA الگو  انجام می گیرد. پرایمر متصل به این رشته forward primer و پرایمر متصل به رشته مکمل reverse primer نام دارند.

🔹بافر PCR
فعالیت هر آنزیمی در یک شرایط ویژه ای  در بالاترین حد خود است.در واقع،بافرها کمک می کنند که این شرایط خاص تشکیل و تا انتهای واکنش حفظ شود .بافر آنزیم Taq پلیمراز که معمولا در غلظت 10X است،شامل Tris HCL، KClو معمولا MgCl2 می باشد.Tris HCl به پایداری pH بین 8 تا 9.5 کمک می‌کند.در واقع دو عامل در این بافر نقش مهمی دارند:اولی وجود یون پتاسیم که منجر به استحکام فرایند اتصال پرایمرها به الگو،‌ هنگام آنیلینگ می‌شود و دیگری وجود یون منیزیم.که همچون کوفاکتور آنزیم پلیمراز،به آن متصل خواهد شد تا آن را به بالاترین فعالیت ساختاری خود برساند.

🔹مراحل PCR
مراحل اصلی واکنش زنجیره ای پلیمراز به ترتیب زیر می باشد:
Denaturation
Annealing
Extension
فرایند دناتوراسیون یا واسرشتن در دمای 96 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد و در طول آن،‌ این افزایش دمای محیط، سبب باز شدن دو رشته الگو از یکدیگر میگردد.سپس مولکول‌های تک رشته‌ای بوجود آمده،‌در مرحله ی بعدی،به عنوان الگو استفاده می شوند.
سپس وارد مرحله ی اتصال می شویم که در دمای بین 55 تا 65 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد و در طول آن، با کاهش دمای محیط، اسباب اتصال پرایمرها به توالی‌های مکمل خود مقدور میگردد. پرایمرها‌ در جهت 5′→3′ خود  و 3′→5′ رشته الگو به آن متصل می‌شوند. بدینگونه،‌ سر 3’آن‌ها که شامل گروه هیدروکسیل آزاد است،‌در تصرف آنزیم پلیمراز ، همانندسازی DNA را در ناحیه هدف ، شروع کند.
در قسمت گسترش یا طویل‌سازی که در دمای 72 درجه سانتیگراد اتفاق می افتد،با افزایش تقریبی دمای محیط، شرایط مناسب برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز و ساخت رشته جدید، ایجاد می شود.
این مراحل و چرخه دمایی در PCR،اغلب بین 20 تا 25  بار تکرار می‌شود.

🧫با ما در انجمن علمی سلول های بنیادی همراه باشید
🌐@Stemcell_Association