После сбора биоматериала необходимо извлечь из него ДНК. Это включает разрушение клеточных мембран и последующее очищение ДНК от различных загрязнений и примесей.
Сам процесс ПЦР проходит в несколько шагов:
1) Денатурация. Образец нагревают до температуры около 94–98 °C, чтобы разделить двухцепочечную ДНК на две одинарные цепи.
2) Отжиг. Предварительно в лаборатории создаются так называемые праймеры – короткие последовательности ДНК, которые являются комплементарными для своеобразной отправной точки. Это нужно для фермента ДНК-полимеразы. Для неё эта последовательность является знаком: "ага, строить нужно отсюда" . Температура понижается до 50-65°C, чтобы праймеры могли связываться с комплементарными областями на одноцепочечной ДНК.
3) Элонгация. Температура повышается примерно до 72°C, оптимальной температуры фермента ДНК-полимеразы. Фермент, стартуя от праймера, подбирает к каждой букве материнской цепи комплементарный нуклеотид из раствора и присоединяет его к растущей дочерней цепочке.
В результате одного цикла из исходной молекулы в идеализированном случае образуются две копии исследуемого участка ДНК.
Затем данный процесс повторяется от 30 до 40 раз. В результате каждого цикла количество копий исследуемого участка ДНК в идеализированном случае примерно удваивается: из одной получается две, из двух – четыре, из четырёх – восемь и так далее.
ПЦР не создаёт новую генетическую информацию, а лишь делает имеющуюся информацию доступной для анализа.
Хорошо. Теперь получили миллионы копий. Но что дальше с ними делать?
Что такое электрофорез?
Электрофорез – это перемещение заряженных частиц под действием электрического поля. Поскольку ДНК имеет отрицательный заряд благодаря фосфатным группам, она движется в сторону положительно заряженного электрода – анода.
Для наглядности принцип можно представить на примере гель-электрофореза. Специальный гель имеет пористую структуру и работает как своеобразное молекулярное сито: небольшие фрагменты ДНК проходят через его поры быстрее, а крупные – медленнее, задерживаясь позади.
В современной криминалистике для анализа STR-профилей чаще используется другой вариант – капиллярный электрофорез. Но принцип остаётся тем же: разделить фрагменты ДНК по размеру и затем определить их длину.
Как это помогает в расследовании?
Для начала с места преступления собирают биологический материал – кровь, слюну, клетки кожи или волосы. После выделения ДНК и проведения ПЦР получают множество копий интересующих фрагментов.
Если представить классический гель-электрофорез, сначала в специальную форму заливают гель определённой концентрации. Она зависит от размера фрагментов ДНК, которые необходимо разделить. Пока гель не застыл, в него устанавливают специальную гребёнку, формирующую небольшие углубления – лунки для образцов.
После застывания гребёнку убирают, а подготовленные образцы помещают в получившиеся лунки. Затем через гель пропускают электрический ток.
Под действием электрического поля отрицательно заряженные молекулы ДНК начинают двигаться к положительному электроду. Благодаря пористой структуре геля небольшие фрагменты проходят через него быстрее, а крупные двигаются медленнее. В результате фрагменты разной длины постепенно разделяются и оказываются на разных участках геля.
После завершения электрофореза фрагменты ДНК визуализируют с помощью специальных красителей. На получившемся изображении можно увидеть отдельные полосы.
На самом деле одна такая полоса – это не одна молекула ДНК, а огромное количество фрагментов примерно одинакового размера, оказавшихся в одном участке геля.Чтобы определить их размер, положение полос сравнивают с ДНК-маркером – набором фрагментов известной длины.
Как это помогает раскрывать дела?
Образцы с места преступления и образцы известных лиц анализируются, в результате чего получают ДНК-профили, которые можно сравнивать между собой или с профилями в базе данных. Так можно исключить людей, чьи ДНК-профили не совпадают с исследуемым образцом, или обнаружить соответствие между образцом с места преступления и образцом известного человека.
Важный нюанс: мы амплифицируем не весь геном подряд, а строго определённые участки – локусы. Их подобрали так, чтобы они находились в некодирующей области, где мутации не вредят организму, но при этом количество повторов в них у разных людей сильно варьируется. Именно длину этих конкретных кусочков и измеряет электрофорез.
Ограничения метода
Несмотря на то, что данный метод является безусловно огромным прорывом в криминалистике, он имеет определенные ограничения.
Количество исходного биоматериала тоже имеет значение.
Однако даже небольшое количество ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР.Загрязнение образца тоже влияет. Деградированная ДНК может давать неполный или плохо интерпретируемый результат, что затрудняет анализ. Примеси вроде пыли, грязи или биологических следов других лиц могут помешать проведению процедуры.
И важно понимать, что сам образец не даёт обозначения, кому он принадлежит. Если профиль человека отсутствует в базе данных, прямого совпадения может не оказаться, даже если его ДНК действительно присутствует среди исследуемых образцов. Такие случаи уже бывали довольно много раз.
Но если у всех людей почти одинаковая ДНК, почему полосы оказываются разными? Ответ скрывается в небольших участках генома, которые называются короткими тандемными повторами. Именно они лежат в основе STR (иногда их также называют SSR)-анализа, о котором поговорим в следующем посте.
Постов долго не было, за что прошу прощения. Сейчас работаю над другими проектами, за август нужно успеть много чего доделать... Всем вдохновения, друзья!