⭕️تکنیک وسترن بلاتینگ ⭕️

 در این تکنیک باندهای پروتئینی از ژل به غشایی مانند نیتروسلولز که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد، منتقل می شوند. در عمل بلاتینگ مولکول­های پروتئین از زمینه ژل خارج می شوند و در سطح غشا در همان موقعیت قرار می گیرند. از این رو به سادگی و با مقدار کمتری از مواد می­توان به مطالعه آنها پرداخت، یا آنها را جدا نمود و مورد استفاده قرار داد. به منظور تشخیص پروتئین ها یا آنزیم های منتقل شده به غشا می­توان از لیگاندهای اختصاصی یا سوبستراهای مربوطه استفاده کرد. آنتی بادی ها از متداول­ترین موادی هستند که برای تشخیص اختصاصی پروتئین ها در غشا بکار می روند. از همین رو چنین روش هایی به ایمونوبلاتینگ معروفند.  از روش وسترن بلات برای تشخیص و آنالیز پروتئین‌ها استفاده می‌شود. با کاربرد این تکنیک دانشمندان قادر خواهند بود پروتئین‌های خاصی از مخلوط پروتئین‌های استخراج شده از سلول‌ها را شناسایی کنند. پس از جداسازی پروتئین‌ها براساس سایز و وزن‌مولکولی روی ژل الکتروفورز، آن‌ها به غشا منتقل شده و توسط آنتی‌بادی‌های اختصاصی شناسایی می‌‌شوند. در مقایسه با تکنیک الایزا، وسترن‌بلات اختصاصیت بالاتری دارد، این در حالی است که روش الایزا نیز دقت نسبتا بالایی دارد. در واقعا روش وسترن‌بلات به دلیل هزینه بالا، بیشتر به عنوان آزمون تاییدکننده روش الایزا مورد استفاده قرار می‌گیرد. به عبارت دیگر معمولا برای نمونه هایی که در تست الایزا مثبت شده اند، از تکنیک وسترن بلات(هزینه بالاتر از الایزا) که اختصاصیت بالایی دارد، استفاده می شود.

 

⭕️مراحل انجام وسترن بلات ⭕️

روش وسترن بلات براساس نام ابداع کننده آن W. Neal Burnette نامگذاری شده است. این روش برای تشخیص، تجزیه و تحلیل پروتئین در یک نمونه معین استفاده می‌شود و مراحل زیر را شامل می‌شود:

📌در اولین مرحله جداسازی پروتئین از نمونه‌های مورد نظر انجام می‌شود.
پس از آن بتا-مرکاپتواتانول (BME) و سدیم دودسیل سولفات (SDS) به پروتئین اضافه می‌شود
.
📌سپس، پروتئین متصل به SDS در چاهک‌های ژل الکتروفورز قرار می‌گیرد. به منظور تعیین وزن مولکولی سایر پروتئین‌ها، یک نشانگر وزن مولکولی نیز در یکی از چاهک‌ها بارگذاری می‌شود. پس از آن سایر نمونه‌ها در چاهک‌های باقیمانده قرار می‌گیرند.

📌پس از بارگیری نمونه‌ها و نشانگرها، جریان در ژل برقرار می‌شود. پروتئین به قطب مثبت چاهک یعنی به سمت پایین کشیده می‌شود، زیرا پروتئین با پیوندی محکم به SDS متصل است که بار منفی دارد. حرکت پروتئین با اندازه آن رابطه معکوس دارد.

📌بعد از این مرحله ، ژل در برابر غشایی قرار می‌گیرد و با قطع جریان در ژل، تمام پروتئین‌ها به غشا منتقل می‌شوند.
در این مرحله روش ایمونوبلاتینگ (Immunoblotting) باید انجام شود. غشاهای مورد استفاده در این روش معمولا ظرفیت زیادی برای اتصال به پروتئین‌ها دارند، به همین دلیل ممکن است با اتصال پروتئین‌ها به مواد نشان‌دار مانند آنتی بادی‌ها، در روند تشخیص اختلال ایجاد شود. در این روش ابتدا غشا را با پروتئین غیراختصاصی مسدود می‌کنند تا از اتصال آنتی بادی به غشایی که پروتئین‌های مورد نظر در آن وجود ندارد، جلوگیری شود.

📌پس از آن آنتی بادی اولیه به محلول اضافه می‌شود. این آنتی بادی‌ها مسئول شناسایی یک دنباله آمینه اسید خاص هستند. پس از این مرحله یک مرحله شستشو وجود دارد تا آنتی بادی اولیه اضافه از سطح واکنش خارج شود و آنتی بادی ثانویه اضافه شود.

📌اکنون این آنتی بادی‌ها با آنزیم کونژوگه می‌شوند و آنتی بادی اولیه را شناسایی می‌کنند. سرانجام، مرحله شستشوی دیگری برای از بین بردن آنتی بادی ثانویه اضافی انجام می‌شود.
در این مرحله با استفاده از روش کمولومینسانس (chemiluminescence) برای تشخیص استفاده می‌شود. به محض افزودن سوبسترا، نور از آن ساطع می‌شود (واکنش بین آنزیم و سوبسترا انجام می‌شود) و با تصویربرداری با دستگاه‌های آشکار ساز این نور قابل ردیابی است.
 
⭕️برنامه‌های کاربردی وسترن بلات⭕️

✅تشخیص حالت فسفریلاسیون پروتئین
✅تشخیص تغییرات میزان پروتئین در طول درمان‌های دارویی
✅تشخیص تغییرات سطح پروتئین در فازهای زمانی
✅شناسایی ایزوفرم‌های کوتاه شده پروتئین‌ها
✅شناسایی پروتئین‌های برچسب خورده یا نشان‌دار

#فناوری
#وسترن_بلات

💜کمیته تحقیقات و فناوری دانشجویی پردیس بین الملل💜

@pardis_Srcmubabol